BIOENERGETICA MITOCONDRIAL
Hipótesis quimiosmótica y Potencial electroquímico de protón
Existen numerosos resultados experimentales que indican que la energía que proviene de la cadena respiratoria es la que se utiliza para formar ATP. La síntesis de ATP la lleva a cabo la enzima ATPsintasa(o complejo V fig. 10.3)
Sin embargo esta enzima no es capas de captar directamente la energía de oxido reducción para sintetizar ATP. El descubrimiento intimo de cómo la energía de oxido-reducción se transforma en energía química han sido uno de los capítulos de la bioquímica que mas se han discutido.
Históricamente, vale la pena mencionar que en un principio se pensó que en las reacciones que en las que se desprendían más de 7500 calorías, los acarreadores de electrones podrían formar un complejo químico con alto contenido energético. Esa hipótesis se conoció como hipótesis química que postulaba que la energía de dicho compuesto se utilizaba para impulsar la síntesis de ATP. Sin embargo, la hipótesis resulto insostenible, ya que nunca se logro aislar de las mitocondrias un compuesto con alto contenido energético que fuera precursor del ATP.
Al principio de la década de 1960, P. Mitchell (Mitchell1961) propuso que la síntesis de ATP se llevaba a cabo a través de un mecanismo que se conoce como hipótesis quimiosmótica. En un principio se recibió con gran escepticismo, pero en la medida que se acumularon datos experimentales, la hipótesis llego a convertirse en el dogma central de la bioenergética. Es de vital importancia señalar que los principios de la hipótesis se aplican tanto a la transducción de energía en las mitocondrias, como a aquella que ocurre en los organismos fotosintéticos y en la membrana plasmática de bacterias, estructuras celulares en las que también hay cadenas de transporte de electrones y ATPsintasas.
En la hipótesis quimiosmótica, se visualiza el transporte de electrones da origen a una fuerza protomotriz (en terminología de Mitchell), o un gradiente de H+, que es una forma de energía. Siguiendo a Mitchell, la energía del gradiente de H+ la capta y la utiliza la ATPsintasa para formar ATP. En otras palabras, la fuerza protomotriz es el intermediario por el cual la energía de oxido-reducción de la cadena respiratoria se transforma en la energía del ATP. La figura 10.6 muestra en forma esquemática la hipótesis quimiosmótica.
Uno de los postulados fundamentales de la hipótesis quimiosmótica es que, para que exista ATP, es indispensable que el proceso ocurra en una membrana impermeable a H+ existen numerosos experimentos en mitocondrias, cloroplastos y membranas plasmáticas de bacterias que indican que esto es correcto y es de importancia señalar que nunca se ha visto síntesis de ATP acoplado a un sistema de oxido-reduccion en un sistema que no sea membranal. En cuanto a la síntesis de ATP se desarrollaron metodólogas para aislar las membranas externa e interna y la matriz mitocondrial. Así se encontró que la membrana interna tiene la ATPsintetasa y todos los componentes de la cadena respiratoria: también se demostró que en la membrana interna es donde se lleva a cabo la fosforilación oxidativa. A la preparación de la membrana interna mitocondrial se le conoce como partículas submitocondriales: en esta preparación se han hecho experimentos más importantes sobre los mecanismos moleculares de la conservación de energía.
La hipótesis quimiosmótica se puede resumir con la siguiente ecuación.
La ecuación se entiende fácilmente si se recuerda que, de acuerdo con la hipótesis quimiosmótica, el transporte d electrones por algunos de los componentes de la cadena respiratoria se acompaña de la translocacion de H+ de un lado a otro de la membrana (fig10.6). En las mitocondrias el movimiento de H+ es de la matriz mitocondrial hacia el exterior de las mitocondrias esto da lugar a i) una distribución asimétrica de cargas en el interior de las mitocondrias queda más negativo que el espacio exterior (Δψ), y ii) una distribución asimétrica de H+, en la que el pH exterior es mas acido que en el interior (ΔpH). Las distribuciones asimétricas están fuera del equilibrio y por lo tanto, son una forma de energía, esta es la que el ATPsintasa utiliza para formar ATP.
Figura19-17 Modelo quimiosmótico. En esta versionsencilla de la teoria quimiosmótica aplicada a las mitocondrias, los electrones del NADH y otros sustratos oxidables pasan a través de una cadena transportadores distribuidos asimetricamente en la membrana interna. El flujo electronico esta acompañado de la transferencia de protones a través de la membrana, produciendo un gradiente quimico (ΔpH) y electrico (Δψ). La membrana mitocondrial interna es impermeable a los protones sólo pueden volver a penetrar a la matriz a través de canales especificos de protones (F0).la fuerza protón-motriz que impulsa el retorno de los protones a la matriz proporciona la energia para la sintesis de ATP catalizada por el complejo F1 asociado con F0.
Estructura y función de la cadena respiratoria
La cadena del transporte de electrones que lleva a cabo la fosforilación oxidativa esta presente en muchas copias de la membrana mitocondrial interna. También se conoce como cadena respiratoria. Contiene aproximadamente como una 40proteinas, de las cuales alrededor de 15 están directamente implicadas en el transporte de electrones. La mayoría de estás proteínas están embebidas en la membrana en la bicapa lipidica la cadena únicamente funciona si la membrana esta intacta, lo que hace muy difícil su estudio. Sin embargo los componentes de la cadena respiratoria de electrones, como otras proteínas de membrana, pueden ser solubilizados utilizando detergentes no iónicos (véase fig.11-28)
, purificados y después de reconstruir una cadena funcional en pequeñas vesículas de membrana. Tales estudios revelan que la mayor parte de las proteínas implicadas en la cadena de transporte de electrones de la mitocondria están agrupadas en tres grandes complejos enzimáticos respiratorios, cada uno de los cuales contiene proteínas cada complejo tiene proteínas transmembrana que anclan firmemente todo el complejo proteínico a la membrana mitocondrial interna. Los tres complejos enzimáticos respiratorios son i) el complejo de la NADH deshidrogenasa, ii) el complejo del citocromo oxidasa b-c1, iii) el complejo de la citocromo oxidasa. Cada uno tiene iones metálicos y otros grupos químicos que forman una vía para el paso de electrones a través del complejo. Los complejos respiratorios son lugares en los que se bombean los protones; de cada uno de ellos es como una maquina proteica que bombea protones a través de la membrana mientras los electrones son transferidos a su través.
Fosforilación oxidativa y síntesis de ATP
Complejo v
La ATP-sintetisa (también llamada complejo F0-F1, o bomba de protones ATP-asa) no forma parte de la cadena respiratoria sino que se encuentra acoplada a esta para llevar a cabo la fosforilación oxidativa; esto es no realiza reacciones de oxido reducción como el resto de los complejos, sino que utiliza la energía del gradiente electroquímico de protón generado por la cadena respiratoria para sintetizar ATP a partir de ADP y Pi. La ATP-sintetasa se ha conservado evolutivamente y, se presenta tanto en procariontes como en eucariontes, realizando la misma función. En la mitocondria se encuentra en la membrana interna orientando su parte catalítica hacia la matriz, en bacterias se ubica en la membrana plasmática, y en los cloroplastos en la membrana del tilacoide dirigida hacia el estroma. La función de la enzima es tan universal, que incluso se han hecho experimentos reconstituyendo ATP-sintetasas de la planta en células de mamífero y se ha encontrado que son funcionales.
La ATP-sintasa mitocondrial es una ATPasa del tipo F, similar en la estructura y mecanismo a las ATP sintasas de los cloroplastos y eubacterias. Este gran complejo enzimático de la membrana mitocondrial interna cataliza la formación de ATP a partir de ADP y Pi, acompañada por el flujo de protones desde el lado P al N de la membrana (ec.19-10). La ATPsintasa, también se la denomina complejo V, tiene dos componentes distintos: F1, una proteína periférica de la membrana, y Fo, que es una proteína integral de la membrana. La letra del subíndice “o” en Fo indicaque es sensible a la oligomicina.F1 fue el primer factor identificado como necesario para la fosforilación oxidativa. Al extraer cuidadosamente el Fi, las vesículas “desnudas” aun contienen cadenas respiratorias intactas y la porción Fo de la ATPasa sintasa. Las vesículas pueden catalizar la transferencia de electrones del NADH al O2, pero no conducen un gradiente de protones: Fo tiene un poro protónico a través del cual los protones se escapan tan rápidamente como son bombardeados por la transferencia electrónica, y sin un gradiente de protones, las vesículas que carecen de F1 no puede sintetizar ATP. F1 aislado cataliza la hidrólisis de ATP (reacción inversa a la síntesis) lo cual hizo que se denominara ATPasa F1.cuando se adiciona una preparación de F1 aislado a tales vesículas, se reasocia con Fo, tapando el poro protónico y restaurando la capacidad de las membranas para acoplar la transferencia de electrónica y la síntesis de ATP. El gradiente de protones impulsa la liberación del ATP de la superficie de la enzima aunque la ATPasa equilibra el ATP con ADP + Pi, el ATP recién sintetizado no abandona la superficie de la enzima en ausencia de gradiente de protones. Es el gradiente protónico que el enzima libere el ATP de su superficie. Para que la síntesis de ATP sea continua el enzima debe ciclarse entre la forma que une ATP muy fuertemente y una forma que libera ATP. El F1mitoconndrial tiene nueve subunidades de cinco tipos distintos, con la composición de α3β3γδε. Cada una de las sub unidades β tiene u sitio cata lítico para la síntesis de ATP. La determinación cristalográfica por E. Walker y colaboradores muestran detalles para poder explicar el mecanismo catalítico de la enzima.la porción en forma de pomo que sobresale de F1 es una esfera aplanada formada por las subunidades α y β alternadas con la reordenación en forma de gajos de naranja (ver fig.a-c) los polipeptidos que constituyen el tallo se reordenan de manera asimétrica en las estructura cristalográfica de F1 con dominio de la subunidad γ actuando como el eje central que atraviesa F1 y otro dominio de γ asociado con una de las subunidades β, la designada β-vacía (fig. c) aunque la composición de las tres subunidades β es idéntica sus conformaciones difieren en la parte por la asociación de la subunidad γ con una de las tres las subunidades δ y ε no se revelan en estos estudios cristalográficos. Las diferencias de conformación entre las subunidades β se extiende a las diferencias de los sitios de unión del ATP/ADP. Cuando se cristalizo la proteína en presencia de ADP y App(NH)p, un análogo estructural muy parecido al ATP pero que no puede ser hidrolizado por la actividad de la ATPasa de F1, se encontró App(NH)p en el sitio de la primera subunidad β, ADP en la segunda y se hallo que la tercera se encontraba vacía. Las correspondientes conformaciones de la subunidad β se denominan β-ATP (rojo), β-ADP (amarilla) y β-vacía (no contiene nucleótido), (Ver fig. c).
Esta diferencia en la unión de los nucleótidos entre las tres subunidades es esencial en el mecanismo del complejo.
El complejo Fo que forma el poro protónico esta compuesto por tres subunidades, a, b, c, en la proporción ab2c10-12. La subunidad c es un polipéptido pequeño (Mr 8000), muy hidrofobico que consiste casi exclusivamente en dos hélices transmembrana, con un pequeño lazo que se extiende desde el lado de la matriz de la membrana.los extremos amino de cada subunidad c forman el circulo interno; circulo externo se forma con el extremo carboxilo de las mismas.(ver fig. d, e) Las subunidades δ y ε respectivamente forman una especie de pie y de pierna que sobresalen del lado de debajo de F1 (membrana), sujetándose fuertemente en el anillo que forman las subunidades c.
La catálisis rotacional es la clave en el mecanismo de unión y cambio de la síntesis de ATP, sobre la base de detallados estudios cinéticos y de unión las reacciones catalizadas por FoF1, Paul Boyer propuso un mecanismo de catálisis rotacional en el que los tres sitios activos situados sobre F1 se alternan en la catálisis de la síntesis de ATP. Una subunidad β determinada empieza en conformación β-ADP, que se une ADP y Pi del medio circundante. A continuación la subunidad cambia de conformación, adoptando la forma β-ATP que se une y estabiliza fuertemente el ATP, lo que comporta el rápido equilibrio del ADP + Pi con el ATP en la superficie de la enzima. Finalmente la subunidad cambia hacia la conformación β-vacía, que tiene una afinidad muy baja por el ATP, por lo que el ATP recién sintetizado se libera de la superficie de la enzima. Cuando esta enzima vuelve a adoptar la conformación β-ADP se une ADP + Pi, con lo que inicia otra ronda de catálisis.los cambios de conformación, esenciales en este mecanismo, están impulsados por el paso de protones a través de la porción Fo provoca que el cilindro formado por las subunidades c y la subunidad γ anclada roten alrededor del eje mayor de γ, que es perpendicular al plano de la membrana.la subunidad γ pasa a través del centro del esferoide α3β3, que se mantiene quieto con respecto a la superficie de la membrana gacias a las subunidades b2 y δ (ver fig. f) con cada rotación de 120°, γ se pone en contacto con una subunidad β diferente y el contacto provoca el cambio de la subunidad β a la conformación β-vacía.
Inhibidores y desacoplantes
Inhibidores del complejo I (INAH: Ubiquinona óxido-reductasa)
Rotenona: inhibe la transferencia de electrones de la NADH deshidrogenasa a la UQ, posiblemente actué a nivel de N2.
Piericidina A: es un insecticida y antibiótico aislado de Streptomyces mobareansis. Aunque su estructura no se parece a la rotenona, es un inhibidor tan potente como el, e inhibe el mismo sitio, e incluso algunos autores lo consideran mas potente.
Rhein: es el 4,5-dihidroxiantraquinona- 2 ácido carboxílico, inhibe la NADH deshidrogenasa bloqueando el transporte entre NADH y flavina.
DB18C6: dibenzo-18-corona-6, es un poliéter macrocíclico sintético, que inhibe selectivamente la oxidación de sustratos del sitio I, se ha propuesto que tiene alta afinidad por el fierro de los complejos Fe-S y al formar el complejo con el, impediría el flujo de electrones.
Otros inhibidores del sitio I son: barbitúricos, demerol, mercuriales y pentóxido de vanadio.
Inhibidores del complejo II (Succinato: Ubiquinona óxido- reductasa)
La transferencia de electrones del succinato a la ubiquinona es inhibida por TTFA (2-tenoiltrifluroacetona), principalmente.
Inhibidores de Ubiquinona y complejo III (Ubiquinol: citocromo c óxido –reductasa)
Antimicina A: uno de los inhibidores más estudiados de este complejo, que actea a nivel de citocromo b566 inhibiendo el transporte de electrones y la reducción de la semiquinona Qi.
Mixotiazol: inhibidor de los centros rédox de bajo potencial, cuyo efecto es sobre la quinona que se encuentra en la membrana orientada hacia el lado del espacio intermembranal Q0, que impide el paso de los electrones al centro Fe-S.
BAL: 2,3- dimercaptopropanol (anti-Lewisita británica), destruye el centro Fe-S.
Inhibidores del complejo IV (Citocromo c Oxidasa)
DCCD: Diciclohexiol-carbidiimida, inhibe la translocación de protones, actúa a nivel de la subunidad III.
Cianuro y CO2: inhiben al centro a3-CuB.
Polilisina: inhibe la oxidación del citocromo c.
Inhibidores del complejo V (ATP-sintetiza)
DCCD: se une a una subunidad específica de F0, e inhibe la translocación de protones.
NFB-Cl (4-cloro-7-nitrobenzofurazano), fenilglioxal, efrapeptina,aurovertina:reacciona con la suunidad β, bloqueando en el sitio activo.
Oligomicina: se une a la proteína del cuello, OSCP, e inhibe la translocación de protones junto con la hidrólisis de ATP.
Otros agentes que inhiben la hidrólisis de ATP son: venuricidina, mercuriales, sulfato de trialkitina.
Desacoplantes
Dinitrofenol: desacopla el transporte de protones, pasando a través de la membrana acarreando H+ a través de la membrana y disipa el gradiente electroquímico y entonces la fosforilación oxidativa no se lleva a cabo.
Valinomicina: inoforo de K+ la parte eléctrica neutraliza el gradiente electroquímico, no funciona la ATPasa, sigue funcionando la cadena respiratoria.
Nigericina: antiport K+/H+ elimina el H+ de un lado, parte química del gradiente electroquímico.
Proteína termogenina o UPCs (proteínas desacoplantes de la membrana): crea un canal de H+, el gradiente electroquímico se disipa en forma de calor, sigue funcionando la cadena respiratoria.
Medición del consumo de oxígeno
En muchos laboratorios se ha estudiado cuanto ATP se forma durante el viaje de los electrones a través de la cadena respiratoria y que es lo que sucede con la formación de ATP. Uno de los experimentos clásicos consiste en medir la velocidad con que se consume oxigeno cuando las mitocondrias están formando, o no, ATP. En estos experimentos, se incuban mitocondrias con sustrato oxidable y fosfato en el medio en el que se conserva la estructura y función de las mitocondrias. Se hace notar que en estas condiciones, no se forma ATP, ya que el sistema no tiene incluido ADP. En este caso estado, la velocidad a la que las mitocondrias consumen oxigeno es baja, pero el consumo de oxigeno aumenta dramáticamente cuando se añade ADP. Experimentalmente se puede ver que en este último estado las mitocondrias sintetizan ATP a partir de ADP y fosfato que se introdujo. Otro dato importante en estos experimentos es que la velocidad respiratoria disminuye a su nivel original cuando todo el ADP se ha trasformado en ATP.
Es de importancia señalar que el experimento de la figura10-5 muestra la formación de ATP, o sea la fosforilación del ADP, esta íntimamente unida a la respiración, o sea a la oxidación de sustratos. De hecho, el proceso general de formación de ATP acoplado a la oxidación se conoce como fosforilación oxidativa.
En estos experimentos también se a calculado cuanto ATP se forma por átomo de oxigeno consumido (figura10-5). Se ha visto que durante la oxidación del sustrato que depende de NAD, la cantidad de ATP que se forma por átomo de oxigeno es cerca a 3; con succinato como sustrato que alimenta electrones a la coenzima Q por acción de la deshidrogenasa succínica, la cantidad de ATP sintizado es cerca de 2.con ascorbato, un sustrato no natural que alimenta electrones al citocromo c, solo se forma un ATP. Estos datos ilustran que la cantidad de ATP que se forma depende del sitio de la cadena respiratoria al que penetran los electrones, lo cual esa totalmente de acuerdo con los cambios de energía que ocurren durante el paso de electrones por la cadena respiratoria es decir solo se utiliza NADH como sustrato, los electrones pasan por tres sitios en los que se libera mas de 7,500 calorías (figura 10-4). Cuando los electrones pasan solo por dos sitios en que se libera más de 7,500 calorias, únicamente se forman dos ATP, como es el caso mostrado en la figura 10-5.
Las mitocondrias son la principales proveedoras de energía química en forma de ATP, y son las responsables del uso de más del 90% del oxigeno en la célula. Se ha estimado que cerca de 1-5% del oxigeno consumido por las mitocondrias es convertido a especies reactivas de oxigeno en condiciones fisiológicas normales. Por lo tanto la mitocondria es la fuente intracelular principal y también propio blanco de estos radicales libres (Wei, 1998).
Genoma mitocondrial y enfermedades relacionadas
Descripción general de la biogénesis mitocondrial
Las mitocondrias humanas contienen su propia molécula circular de ADN en forma de doble cadena, que engloba 16.569 pares de bases que codifican 13 proteínas, las cuales constituyen una parte de los 5 complejos enzimáticos involucrados en el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa1. Los genes de ADNmt que codifican proteínas son transcritos en forma de ARNm específicos que se traducen en un complejo específico de síntesis ribosoma/proteína. El ADNmt también codifica parte de la maquinaria de síntesis proteica mitocondrial, como 2 ARN ribosómicos (ARNr) y 22 ARN de transferencia (ARNt), como se observa en la figura 2. En general, cada célula cardíaca contiene múltiples mitocondrias (50-100) y cada mitocondria contiene múltiples copias de ADNmt (1-10 moléculas/mitocondria). La biogénesis mitocondrial está aumentada durante la hipertrofia cardíaca, en el tratamiento con diversos agentes como, por ejemplo, la tirotoxina o los agentes xenobióticos, durante la estimulación eléctrica y en el ejercicio2. En la actualidad, todavía no han sido completamente caracterizados los mecanismos que regulan los niveles de ADNmt específicos del corazón, ni el número global de mitocondrias3. Sin embargo, está bien establecido que las mutaciones puntuales patogénicas y las deleciones a gran escala en el genoma mitocondrial, así como la depleción generalizada del ADNmt, tienen consecuencias graves en órganos como el corazón, en donde el ATP derivado de la fosforilación oxidativa es necesario para mantener la contractilidad miocárdica.
Por el contrario, el genoma nuclear codifica la dotación completa de proteínas involucradas en la replicación y transcripción del ADNmt, los componentes proteicos de los ribosomas mitocondriales, múltiples proteínas estructurales y transportadoras de las membranas mitocondriales y el resto de las subunidades peptídicas (actualmente se calcula que son 71) de los complejos respiratorios (las que no forman parte de las 13 subunidades peptídicas codificadas por el ADNmt). Estas proteínas codificadas por el núcleo son sintetizadas en ribosomas citosólicos, dirigidas a las mitocondrias e importadas por procesos complejos. La regulación cardíaca específica de una parte de los genes nucleares que codifican proteínas de la fosforilación oxidativa puede estar mediada por una expresión génica variable (p. ej., la subunidad beta de la sintasa de ATP se expresa más en el corazón que en otros tejidos) sensible a una gran variedad de estímulos fisiológicos y ambientales, y por la presencia de isoformas específicas de tejido para péptidos específicos (p. ej., existen isoformas específicas cardíacas para genes que codifican las subunidades VIa, VIIa y VIII de la oxidasa del citocromo C). Por tanto, puede esperarse que determinadas mutaciones en genes nucleares involucrados en la biogénesis mitocondrial contribuyan en parte a los defectos observados en las enzimas cardíacas mitocondriales y en el ADNmt, como el aumento de la incidencia de deleciones de ADNmt a gran escala, y depleción de ADNmt asociados a alteraciones cardíacas. Hasta el momento se han identificado unas pocas mutaciones en los genes nucleares que afectan a la biogénesis mitocondrial y que conducen a alteraciones cardíacas. Mientras que el genoma nuclear controla la biosíntesis mitocondrial, los genes de ADNmt presentan una tasa de mutaciones mucho más elevada, carecen de histonas, tienen un mecanismo de reparación de ADN limitado y se encuentran expuestos a especies reactivas del oxígeno generadas por la cadena de transporte electrónico. La búsqueda de mutaciones, tanto en el genoma nuclear como en el mitocondrial, así como las mutaciones que afectan a la intercomunicación entre los genomas, es actualmente un campo en expansión.
Genes mitocondriales y mutaciones
(a) mapa de DNA mitocondrial humano en el que se muestran los genes que codifican proteínas del complejo I, la NADH deshidrogenasa (ND1 a ND6); el citocromo b del complejoIII (cyt b); las subunidades de la citocromo oxidasa (complejo IV) (COI a COIII); y dos subunidades de la ATP sintasa (ATPasa6 y ATPasa8). Los colores de los genes corresponden a los colores de los complejos mostrados en la figura 19-7. También se muestran los genes de los RNA ribosómicos (rRNA) y de una serie de RNA de transferencia específicos de la mitocondria; la especificidad de los tRNA esta indicada mediante el código de una letra para los aminoácidos. Las flechas indican las posiciones de las mutaciones que provocan la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) y la enfermedad de la epilepsia mioclónica y de la fibra roja rota (MERRF). Los números entre paréntesis indican la posición de los nucleótidos alterados (el nucleótido numero 1 esta en la parte superior del circulo y la numeración transcurre en sentido contrario a las manecillas del reloj.
figura 19-7
La mitocondria y el corazón, José Marín-Garcíaa y Michael J Goldenthala, The Molecular Cardiology and Neuromuscular Institute. Highland Park, NJ. EE.UU.
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