Las respuestas agudas de hígado a etanol incluyen generación mitocondrial de ATP, mayor formación de especies reactivas de oxigeno (ROS), peroxidación lipídica y supresión de oxidación de ácidos grasos. Metabolismo mitocondrial requiere un intercambio continuo de sustratos entre el citoplasma y la matriz mitocondrial. VDAC es el único canal en la membrana externa mitocondrial aún no identificados que facilita el intercambio de los pequeños metabolitos hidrófilos entre el espacio intermembrana mitocondrial y el citoplasma. Aunque la exposición aguda de etanol induce la disfunción mitocondrial en hepatocitos, se sabe poco sobre el mecanismo molecular (s) subyacentes mediada por etanol alteraciones de metabolismo mitocondrial .
Para el estudio se aislaron los hepatocitos y se colocaron en un buffer intracelular frio con alguno inhibidores de proteasas, se la agrego digitonina que ayuda a la permeabilizacion, se midio la actividad de la lactato deshidrogenasa, se midio la actividad de la adenolato kinasa con la reducción de NADP+ utilizando
Hexoquinasa/glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en presencia
de glucosa y ADP, se midio la respiración con el consumo de oxígeno antes y después del tratamiento con digitonin, se utilizo Western blot para el aislamiento de membrana, se hiso el cultivo celular, se incubo y se observo los cambios ocurridos enla membrana.
se uso microscopia confocal de laser para observar los cambios en la membrana y en la mitocondria.
la diginonina permeabiliza el plasma y la membrana externa de la mitocondria de los hepatocitos.ya que la digitonina es un detregente no ionico que permeabiliza las membranas de los hepatocitos formando poros,
aunque liberando citoplasma y sustratos mitocondriales endógenas no altera estructura mitocondrial o la capacidad de las mitocondrias para mantener unpotencial de membrana en presencia de sustrato exógeno respiratorio.
Inhibición de la respiración por bloqueo VDAC
Para evaluar la importancia de VDAC en la fosforilación oxidativa, tratamos de hepatocitos de permeabilizado de digitonin con (KPA), un inhibidor de VDAC. La respiración de los hepatocitos tratada con etanol en presencia de ADP y succinato aumentaron un 92% en células sin tratamiento. Después de permeabilización con baja digitonina, control de respiración y tratamiento de etanol los hepatocitos fue 103 ± 2 y 62 ± 2 nmol o2/min/106 células, respectivamente, mostrando una 40% de inhibición de la respiración por membrana permeabilizada de hepatocitos después de la exposición de etanol. Esta inhibición fue revocada por altas dosis de digitonina, que restauró la respiración en las células en hepatocitos tratados con etanol, casi la misma que en hepatocitos no tratados. Por lo tanto, tratamiento de etanol suprime la respiración de los hepatocitos permeabilizado con baja digitonina.
Este efecto inhibitorio fue superado cuando las membranas mitocondriales exteriores fueron permeabilizadas con alta cantidad de digitonina.
Además evaluar el efecto del etanol sobre la permeabilidad de la membrana externa, de los hepatocitos tratada con etanol y se permeabilizada con baja concentración de digitonina y AK se midió la actividad en el sobrenadante (citosol) y pellets (permeabilized hepatocitos con mitocondrias intactas). Por el contrario, la actividad mitocondrial AK en el sedimento disminuyó de 42% del total de la actividad en las células sin tratamiento al 24% después del tratamiento de etanol. Posterior exposición de etanol hepatocitos tratados de alta digitonina se restauraro la actividad mitocondria AK al 48% del total. Recuperación de mitocondrial Actividad de AK en hepatocitos con etanol tratados con dosis alta Digitonina se asoció con la liberación de citocromo c confirmando esa alta dosis de digitonin permeabiliza la membrana mitocondrial exterior.
la entrada de RhoDex en hepatocitos y al espacio intermembranal mitocondrial, DIDS, un inhibidor no selectivo de VDAC se agregó para cerrar VDAC y atrapar Rho- Dex dentro del espacio intermembranal. Tratamiento previo de etanol de hepatocitos disminución la trampa mitocondrial RhoDex. En promedio, disminución de etanol y retención de RhoDex mitocondrial en un 35% en comparación con las células no tratadas. Tratamiento previo de los hepatocitos con el inhibidor VDAC, DIDS, disminuiyo la absorción de RhoDex mitocondrial en 56% en comparación con el control células sin afectar a la retención MTG o morfología mitocondrial, consistente con la conclusión de que RhoDex entra en el espacio intermembrana a través de VDAC. El metabolismo mitocondrial normal requiere continuo intercambio de metabolitos entre el citoplasma y la matriz mitocondrial. Por el contrario, los metabolitos hidrófilos mitocondriales cruzan la membrana externa y entrar en el espacio intermembranal principalmente a través de VDAC].
Se evaluó la permeabilidad de la membrana externa mitocondrial en hepatocitos normal y tratados con etanol.
La permeabilización selectiva de membrana plasmática con digitonina baja (8-20 lM) fue confirmado por liberación de DHL y captación de centro azul con retención de AK mitocondrial y citocromo c, mientras que digitonin mayor (80 lM) causó la permeabilización de la membrana externa con la liberación de citocromo c y AK mitocondrial intermembrana). Digitonin mayor no causa permeabilización de la membrana interna, desde entonces mitocondrial se mantuvo el potencial de membrana.
Al mismo tiempo, tratamiento de control y etanol expuestos células con baja digitonina dio lugar a una mayor control de la respiración (_100 nmol/min/106células) en comparación con células expuestas a etanol (_nmol 60, min, 106células), demostrando supresión de 40% de la tasa de respiración después de la exposición de etanol.
Los metabolitos de etanol pueden persistir después de lavado de etanol para explicar el aumento. Digitonina alta restaurado la respiración de los hepatocitos tratada con etanol a casi al mismo ritmo que los hepatocitos sin tratar.
Del mismo modo, tratamiento de etanol inhibe la accesibilidad de mitocondrial
AK a sus sustratos. Aunque tratamiento de etanol no tuvo efectos sobre la actividad de citosólicas AK, actividad de AK mitocondrial fue el 43% menos después del tratamiento de etanol que sin tratamiento. Alta digitonina con nuevo restaurado mitocondrial actividad AK después de tratamiento con etanol a casi los mismos niveles que en hepatocitos sin tratar
La disminución de la permeabilidad de la membrana externa después de etanol fue confirmado mediante microscopía confocal.
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